또한 최근 성체 속에 ES세포와 동일한 전능성을 갖고 있는 줄기세포가 존재한다는 사실이 보고돼 기존의 줄기세포에 대한 교과서적 위계질서는 완전히 새로 씌여지게 될 가능성이 있다. 한편 중증 심부전에 대해 좌실성형술을 실시하고 있는 교토대학 심장혈관외과 코메다 마사시교수는 최근 발전된 재생의학적 접근법을 도입하여 동물모델에서 확실한 반응이 있었다고 보고했다. 후쿠다 강사와 코메다 교수에게 순환기 영역에 있어서의 재생의료의 현황과 전망에 대해 알아본다.
성체골수 간엽계줄기세포는 심근세포로 분화한다
심장질환 영역의 최종 단계인 중증심부전에 대한 치료법은 현재로서는 심장이식뿐이다. 하지만 이식 선진국인 미국에서조차 장기 공급률은 10~15％에 지나지 않는다. 일본에서도 1999년에 심장이식이 재개되었는데 정착되기까지는 현실적으로 대단히 힘들 것으로 예상되고 있다. 따라서 심장이식을 대체할 가능성이 있는 치료법에 대한 접근법으로서 심근세포 재생이 주목되고 있다.
후쿠다 강사는 심근세포 재생 전략으로 현재 3가지 방법을 고려 중이다(그림1).
첫째 심근세포에 다시 분열능을 획득시키는 방법, 둘째 비심근세포를 심근세포로 전환시키는 방법, 셋째는 미분화 줄세포에서 심근세포를 분화유도하는 방법이다.
첫번째 전략은 이론적으로는 G0期인 심근세포에 여러 종류의 세포주기 조절유전자를 도입하는 방법을 생각해 볼 수 있지만, 심근세포의 종말분화구조를 해명해야 하기때문에 아직까지는 분열능을 재획득시키는데까지는 이르지 못하고 있다.
두번째 전략은 비골격근세포를 골격근세포로 전환시킬 수 있는 마스터 유전자 myo D의 발견을 계기로, 심근에서의 마스터 유전자 검색이 적극적으로 이루어졌으나 현재까지는 myo D에 필적하는 심근세포 특이적인 강력한 전사인자(轉寫因子)의 존재는 증명되지 않았다.
세번째 전략에서는 모든 장기에서 분화할 수 있는 능력을 갖고 있고 in vitro에서 대량배양이 가능한 ES세포(embryonic stem cell;배성줄세포)가 주목되고, 실제로 그 일부가 심근세포로 분화한다는 사실이 확인됐다. 하지만 사람에 관해서는 윤리적 측면이 문제가 되기 때문에 ES세포는 현실적인 재생의료의 도구는 될 수 없다.
그런데 성체의 골수간질세포 안에 존재하는 간엽계 줄기세포가 골아세포, 연골아세포,지방세포 등 중배엽계세포로 분화하는 능력이 있는 것으로 밝혀졌다.
CMG세포 선별해야
후쿠다 강사는 이 간엽계 줄기세포에 주목하여 간엽계 줄기세포가 발생학적으로 중배엽계에 속하는 심근세포로도 분화할 수 있을 것으로 보고, 자기박동능을 가진 심근세포와 비슷한 세포를 채취하는데 성공했다. 이 세포는 CMG세포(Cardiomyogenesis cell)로 명명되었다.
골수간질세포는 성체골수세포의 대부분을 차지하는 조혈줄기세포와 여기에서 파생하는 혈구계세포의 증식·분화 유지를 위해 작용하는 세포로 알려져 있다.
이 중에 일부 포함된 간엽계 줄기세포는 중배엽계 세포인 stem cell로 알려졌다. 골수세포 전체에서 차지하는 비율은 생쥐(마우스)에서 20만분의 1,사람에서는 더욱 적다고 한다.
생쥐의 대퇴골에서 골수를 적출시켜 배양하여 부유(浮游)하는 세포를 제거한다. 부유계 세포는 혈구계 세포이며, 이들을 제외하면 부착계 세포로서 골수간질세포가 남는다. 이 속에 간엽계 줄기세포가 포함돼있다고 볼 수 있다.
이어 부착계 세포집단을 3개월 이상 장기배양하고 불사화(不死化)세포에 의한 다복제 세포주(株)를 만든다. 이들 세포주에 분화유도제인 5-아자사이티딘을 작용시켜 4주 정도 배양을 계속하면 수백종의 클론을 얻을 수 있다. 이 중 소수이기는 하나 자가 박동하는 세포를 포함하는 클론이 존재한다.
하지만 이 단계에서 박동을 시작해버린 세포는 계대 배양할 수 없다. 가장 유력한 것은 그러한 세포 주변에 존재한다. 즉 박동하는 세포로 분화하는 도중의 단계에 있는 심근아세포라고 불리는 세포가 있고 분열증식능을 갖고 있다. 이것이 CMG세포이다(그림2).
분화유도제로는 여러종류가 알려져 있으나 심근세포의 분화유도에는 DNA탈메틸 화제인 5-아자사이티딘이 가장 효과적이라는 점이 확인되었다. 그 작용은 염색체상의 시토신 잔기에 결합되어있는 메틸기를 제거하여 전사활성을 높이는 일이다.
위와 같이 선별된 CMG세포를 좀더 5-아자사이티딘으로 처리하면,처음에는 섬유아세포와 비슷한 형태를 나타낸 세포의 일부가 미오신을 발현하여 가늘고 긴 막대 모양을 나타낸다.
좀더 분화유도를 한 후 2주일이 경과하면 CMG세포의 대부분은 자연히 박동하기 시작하며 이와 동시에 근접하는 미오신 양성세포가 서로 끌어당기듯이 연결되어 근관(筋管)모양의 구조를 형성한다.
CMG세포는 동기(同期)하여 박동한다
근관구조를 형성한 CMG세포는 분화유도 후 3주째에는 분지(分枝)를 뻗쳐 근관구조끼리 접합하여 전체적으로 그물 모양의 외관을 보이게 되며 동기(同期)하여 박동하게 된다. 근관의 길이는 최장 약 3mm에 달하며 박동수가 분당 120~250회로 수축한다.
현미경으로는 전형적인 횡문(橫紋)구조와 핵주변에 풍부한 글리코겐과립,대형 미토콘드리아가 관찰됐다. 유리 미소 전극을 사용하여 기록한 CMG세포의 활동전위는 분화유도 초기에는 모든 것이 동결절형을 보였으나 그 후 시간이 경과하면서 심실근 형태의 활동전위가 널리 인정받게 된 것으로 나타났다.
α-액틴, 미오신 중쇄 및 경쇄 아이소폼에서 CMG세포의 심근세포로 나타나는 표현형을 분석하면 α-액틴은 태아형(skeletal형), 미오신 중쇄도 태아형(β형)이 주체이며 미오신 경쇄는 심실근형(2v)만 인정되어 태아심실근형의 수축단백을 발현하고 있는 것으로 밝혀졌다.
심방성 이뇨 호르몬인 ANP,BNP의 발현도 관찰되었다. 또한 아드레날린 작동성 수용체는 α1 및 β1,β2,무스칼린 수용체는 M1,M2을 발현하고 있었다. 그리고 분화 후 유전자 분석에서는 심근특이적 전사인자인 Nkx 2.5,GATA4, TEF1,MEF2A,MEF2C,MEF2D의 발현이 관찰되었다.
후쿠다 강사는 『골수의 다능성 간엽계 줄기세포의 탈메틸화에 의해 얻어진 CMG세포는 ES세포와는 달리 성인의 골수 내부에서 조달할 수 있으며 이에 추가로 환자 자신의 간엽계 줄기세포을 사용할 수 있다면 이식으로 인한 거부반응도 회피할 수 있다. 장래 심근세포이식에 의한 심부전 치료에 연결시키기 위해서는 당면한 골수 속에서 CMG세포의 근원이 되는 stem cell을 확실하고 간편하게 분리하는 기술을 확립하는 일과 그 다음에 스스로 박동하는 세포를 in vitro로 대량으로 늘리는 기술이 필요해진다』고 말한다.
현 시점에서는 골수 속의 간엽계 줄기세포를 단리하는 단서가 되는 마커는 생쥐로는 어느 정도 밝혀졌다. 사람도 CD29＋,CD44＋,CD45－,CD73＋등 100이상의 마커가 보고되었다고 한다.
간엽계 줄기세포는 내/중/외 3배엽계 세포로 분화한다
그런데 CMG세포를 수립하는 근원이 된 간엽계 줄기세포는 현재 성체 줄기세포(Adult stem cell)또는 체성 줄기세포라 불리고 있다.
이 세포는 성체골수 간엽계 세포에서 CD45＋ 세포와 글리코포린-A 양성세포를 제외한 후 EGF(상피세포 성장인자)나 PDGF-BB(혈소판유래 증식인자)를 첨가하는 등의 조작을 가하여 배양된 세포 중에서 서브클로닝에 의해 단리된 것으로 Multipotent adult progenitor cell이라 명명되었다.
그 빈도는 골수세포 중 107분의 1~108분의 1이라 추산되며 계대배양에 의해서도 세포분열능의 지표로 간주하는 염색체 양쪽의 텔로미어(telomere)가 안정돼 있는 것으로 확인됐다.
후쿠다 강사는 이에 대해 『Adult progenitor cell의 정의는 아직 100％ 확정되지는 않았으나 성체에 잔존하는 줄기세포라는 것은 아마도 균일하지 않고 그 중에도 다양한 캐스캐이드가 있는 게 아닌가 상상할 수 있다. 즉 어느 줄세포도 모든 3배엽계 세포가 되는 것이 아니라 어느 줄기세포는 외배엽에 가까운 stem cell이며 또 어느 세포는 중배엽에 가까운 stem cell로 작용한다.
따라서 우리 CMG세포의 기원인 stem cell은 이번에 보고된 줄기세포의 약간 하류에 위치하는 줄기세포라고 할 수 있다고 본다. 이들 전체가 ES세포에 대응한다는 의미로 adult stem cell이라고 부를 수 있다고 생각한다』고 말한다.
심근증 모델에 심근세포를 이식한다
코메다 교수는 중증의 심부전을 동반하는 확장형 심근증에 대해 좌실성형술(좌실축소술)을 시행하고 동시에 이 대학 내과 그룹과 공동으로 확장형 심근증 래트 개발에 착수하여 이러한 동물모델을 사용해 외과적 처치에 여러 재생의학적 접근을 도입하는 시뮬레이션을 실시하고 있다. 그 중 하나가 좌실성형술과 심근세포이식의 병용요법 실험이다.
허혈성 심근증인 모델 래트에 좌실성형술을 실시하면 시술 후 초기에는 심기능이 현저하게 개선되지만 나중에 재확장되는 경우가 적지 않다. 이에 대해 좌실성형술에 래트에서 유래한 태아 심근 세포이식을 병용한 예에서는 좌실벽의 두께가 유지되고 재확장에 의한 심기능의 증악을 상당히 억제할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.지금까지 집적된 실험에서 좌실성형술 단독, 래트 태아 유래 심근세포 이식군 및 좌실성형술 후 태아심근세포를 절제부위 주변에 이식한 군 사이에서 시술 전후의 좌실단축률 변화에서부터 좌실수축기능이 개선된 정도를 비교한 성적에서는 좌실성형술에 심근세포이식을 병용한 군이 가장 양호한 좌실기능의 개선을 나타냈다(그림3).
bFGF의 서방투여로 혈관신생, 흉골재생 촉진
또하나의 접근은 혈관내피세포의 강력한 증식인자로 알려진 bFGF(basic fibroblast growth factor;섬유아세포증식인자)를 허혈심근부위에 투여하고 혈관신생을 촉진하는 시도이다.
bFGF는 코메다 교수들이 동물모델에서 시도하기 이전에 독일 연구팀이 사람에 투여한 결과를 1998년에 보고한 바 있다. 이 보고에서는 1회성 투여였기 때문에 어느 정도의 효과는 있었으나 일과성으로 끝났다.
코메다 교수는 실험시 투여법을 연구할 필요가 있다고 생각하여 알칼리 처리한 젤라틴에 bFGF를 결합시킨 bFGF함유 젤라틴 입자를 만들어 bFGF의 서방화(徐放化)를 실현했다. 이 bFGF가 함유된 젤라틴 입자를 좌전하행지를 결찰한 래트 허혈성 심근증 모델에 투여하자, 내부에 적혈구가 조밀해진 다수의 신생혈관이 확인된다.
그런데 개흉술 후의 흉골재생과정은 환자의 QOL 또는 ADL을 규정하는 매우 큰 요인이며, 특히 당뇨병의 기초질환을 가진 사례에서는 흉골재생이 늦어지기 쉬우며 창감염이 생기기 쉬운 경향이 있다고 알려져 있다. 코메다 교수는 bFGF가 혈관신생작용 뿐만 아니라 강력한 골재생 작용을 함께 갖고 있다는 사실에 착안하여 bFGF에 의한 흉골재생 촉진도 이와 함께 검토했다.
방법은 streptozotocin 정주(靜注)로 만든 당뇨병 래트에 흉골을 정중절개를 하여 양측 내흉동맥을 채취한 후에 bFGF 함유 젤라틴 시트를 흉골 뒷면에 접착하는 것이다. 이에 따라 시술 후 4주째에는 bFGF 처치군에 흉골주위 조직의 혈류량의 유의한 증가가 나타났으며 골량도 컨트롤 군에 비해 뚜렷한 증가가 나타났다.
심근세포이식, bFGF의 콤비네이션 테라피를 목표로
또한 앞서 말한 접근법의 병용에 따라서는 보다 높은 효과를 기대할 수 있다. 예를 들면 심근경색 부위에 심근세포를 이식하기 전에 bFGF를 병소 내에 서방(徐放) 투여하고 미리 혈관신생을 촉진시켜두고 그 후에 심근세포를 이식한다. 이렇게 하면 세포생착률이 유의하게 증가하고 심수축능력도 유의하게 개선됐다(그림4)『이식된 세포는 저산소, 저혈당 등 생존하기 힘든 조건에 노출된다. 이러한 어려운 환경에 아무리 건강한 세포를 이식해도 약간의 효과 밖에 기대할 수 없을 것이다. 따라서 미리 bFGF를 투여하여 되도록 좋은 환경을 마련한 후에 세포를 이식하려는 것이다.』(코메다 교수)
허혈상태는 심근경색 후의 심부전뿐만 아니라 확장형 심근증에서도 미세하고 산발적으로 발생한다는 견해도 있으며 실제로 좌실성형술을 실시할 때에도 이러한 감촉이 느껴진다고 한다. 따라서 혈관신생의 병용은 확장형 심근증에서도 유용하다고 알려져 있다.
이 교실에서는 bFGF 이외에도 여러 성장인자, 증식인자의 병용을 검토하고 있으며 흥미로운 결과를 얻어냈다.
세포이식에 관해서는 최근 72세인 중증허혈성 심부전 환자의 허혈후 반흔 조직 중에 환자의 광근조직에서 유래한 근아세포(skeletal myoblast)를 이식하여 약 5개월간의 추적조사에서 NYHA 클래스III가 클래스II로 개선되고 안정된 상태를 유지했다고 프랑스 연구팀이 보고했다.
코메다 교수는 『우리 임상시험가로서는 현재 시도할 수 있는 것을 철저히 이용하여 거시적으로나 미시적으로 공략해나갈 전략을 취해야한다고 생각한다. 예를 들면 현재 쥐의 모델 계열에 쓰이고 있는 태아심근세포는,어디까지나 장래에 최적이라 생각되는 세포가 등장한 경우에 대비하는 시뮬레이션이며 가장 효율적인 외과적 수법을 확립해두자는 것이다. 최근 보고된 근아세포의 이식도 매우 흥미롭고 그 외에도 여러 가지 도구로서의 세포나 증식인자, 성장인자가 제기되고 있다. 앞으로 이것들이 어떠한 방향으로 정리되어 갈지 주의깊게 지켜보아야 한다』고 말한다.
코메다 교수는 흉골재생이 가장 빨리 임상응용의 대상이 될 것으로 보고 있다. 또한 향후 5년에서 10년 사이에는 심장이식 적응 리스트에 올라있는 환자 중 비교적 경증인 사람의 4분의 1~3분의 1이 재생의료를 통해 그 리스트에서 제외될 것이라고 코메다 교수는 말한다.