로체스터대학의료센터 신경혈관생물학과 Berislav Zlokovic 교수팀은 “APC에는 뇌졸중으로 장애받은 뇌신경세포를 직접 보호하는 기능을 갖고 있다”고 Nature Medicine (9:338-342)에 발표했다.
Zlokovic 교수는 “APC는 종양억제 단백질인 p53를 전사의존성으로 저해하여 아포토시스 유도 지표인 Bax/Bcl-2비율을 정상화시키고, caspase-3 신호 전달을 억제시켜 저산소 상태의 사람 뇌내피 세포(BEC)에서 발생하는 아포토시스를 직접 억제시킨다”고 설명한다.
“조직플라스미노겐액티베이터(tPA)는 뇌세포에 직접적으로 작용하는 신경독이지만, APC는 아포토시스 유도인자인 p53의 억제를 통해 사람 BEC의 허혈성 세포 손상을 막는다. 이 때문에 APC는 tPA의 신경독 작용을 억제하여 신경을 보호하는 보조 약제로 이용할 수 있다”고 말한다.
교수는 “이번에 확인된 APC의 작용은 예상과는 완전히 달라 뇌졸중을 평가할 때 고려해야할 새로운 사실이 나타났다”고 말하고 “뇌졸중에 효과적인 치료법은 현재 tPA 뿐인데다 그 혜택을 받는 환자는 극히 일부분이다. 이번 지견을 계기로 평생 장애를 안고 가야하는 환자를 구할수 있을 것으로 기대된다”고 말하고 있다.
공동연구자인 스크립스연구소 John H. Griffin씨도 “APC가 허혈성 뇌졸중의 치료에 매우 유용하다는 사실이 증명될 가능성이 있으며 전망이 밝다”고 평가했다.
이번 연구의 in vitro에서는 저산소성 장애가 발병했을 때 8∼24시간내에 사람 BEC의 60∼70%에서 유산 디하이드로게나제(LDH)가 방출되는데, 이 때 APC는 용량의존적인 세포보호작용을 발휘하여 55∼65%의 세포에서 저산소성 장애를 막는 것으로 판명되었다.
게다가 트롬빈의 억제 물질인 히루딘은 APC의 보호활성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
Zlokovic 교수는 “산소 상태가 정상인 사람 BEC의 경우에는, TUNEL법(아포토시스 세포의 조직화학적 검출법으로 널리 이용)에서 양성 소견이 얻어지는 경우는 드물지만, 저산소 상태에서는 65% 이상의 사람 BEC가 TUNEL 양성이고, 아포토시스성 핵변화로 알려져 있는 크로마틴의 응축과 핵의 수축을 나타낸다”는 사실을 이용하여 검증했다.
그 결과, 저산소 상태에서 APC가 존재하는 경우에는 TUNEL 양성 세포수 및 아포토시스성 핵변화를 나타내는 세포수가 유의하게 감소하며, 최대 60% 감소하는 것으로 나타났다.
뇌졸중 치료에 응용, 항아포토시스 작용까지 갖고 있어
실험의 다음 단계에서는 저산소 상태의 사람 BEC에서는 1시간 및 4시간 시점에서 p53의 총량이 각각 2.1배, 1.5배에 상승하는 것으로 나타났다. 동시에 Bcl-2 패밀리 중 아포토시스 유도인자로 알려진 Bax, 그리고 p53의 작용에 의한 전사 산물이 증가한다. 그러나 이와는 대조적으로 아포토시스 억제 작용을 가진 Bcl-2는 대조군의 30∼40%로 저하하고 있었다.
그러나, 이러한 저산소상태의 사람 BEC에서 APC는 2시간, 4시간째에 p53의 양을 각각 77%, 79% 저하시키고, Bax는 65%, 68%, 그리고 APC군에서는 Bcl-2의 양이 대조군에 비해 증가하는 것으로 밝혀졌다.
또한 APC는 복수의 핵기질 단백질을 분해시켜 핵분해를 촉진시키는 주요 프로테아제 caspase-3의 신호전달을 억제시킨다는 사실도 판명됐다.
교수는 인터뷰에서 “제대정맥내피세포(HUVEC)에서는 APC의 작용으로 항아포토시스 유전자라는 Bcl-2의 상동체인 A1, 아포토시스 억제단백질(IAP)-1, 혈관내피형 일산화질소 합성효소(eNOS)의 유전자 발현량이 증가하는 것으로 나타났다. APC는 그러나 허혈성세포에서는 항아포토시스 유전자의 발현량이 증가하지 않았다”며 “항아포토시스 경로의 특이성이 부가적으로 나타났다”고 말했다.
Zlokovic 교수는 “in vitro에서 APC를 이용하여 사람 BEC를 보호하기위해서는 혈관내피단백질 C수용체(EPCR) 및 프로테아제 활성화 수용체(PAR)-1이 필요하며, EPCR이 크게 결손된 뇌졸중 마우스가 in vivo에서 나타난 신경 보호 활성에 대해서도 같은 것으로 나타났다”고 지적했다.
EPCR 중증 결손 마우스를 이용한 in vivo 시험에서는 0.2mg/kg의 APC에서 관찰된 신경보호작용의 약 60%가 소실된 것으로 나타났다.
또한 APC와 PAR-1개열에 대한 항체를 투여한 마우스에서는 24시간 시점에 APC의 신경보호작용이 전혀 나타나지 않았다고 한다.
교수들은 “이러한 in vivo의 결과에서 볼 때 EPCR과 PAR-1이라는 2종류 수용체는 허혈시에 APC의 사람 BEC 보호작용에 필수적이라는 in vitro의 소견이 확인되었다. 이러한 수용체는 in vivo에서의 APC의 신경 보호 작용에 유의하게(각각 P＜0.05, P＜0.01) 기여했다”고 말한다.
마우스를 이용한 시험에서, 고용량의 APC는 운동신경학적 스코어와 뇌의 손상용적을 EPSR이 91%, PAR-1이 65% 저하시키고, 허혈 후 뇌혈류량(CBF)을 30% 개선시켰다. 이와는 대조적으로 저용량 APC에서는 운동신경학적 스코어 및 손상용적은 유의하게 저하했지만, 그 정도는 가벼워 CBF나 피브린 침착, 호중구침착을 개선시키는데는 이르지 못했다.
Zlokovic 교수는 “지금까지는 APC가 직접적인 세포 생존 인자로서 작용하는지, 그렇지 않으면 그 신경 보호 작용이 항응고작용 및 항염증작용에 동반하는 이차적인 것인지 확실하지 않았다”고 말하고 “이번 연구를 통해 APC는 뇌세포에 직접 작용하여 허혈성 손상으로부터 뇌를 보호하는 것으로 나타났다”고 결론내렸다.