제32회 미국골대사학회(ASBMR2010)

도쿄의과치과대학 정형외과 후지타 고지 교수는 생체 내에서 α-T를 선택적으로 수송하는 α-T 수송 단백질(α-TTP)을 녹아웃 마우스(α-TTPKO)에 투여해 비타민E와 골대사와 어떤 관련성이 있는지를 검토한 결과 "비타민E는 파골세포 융합(osteoclast fusion)을 촉진시켜 골량을 감소시킬 수 있다"고 보고했다.

α-T는 골량과 파골세포의 분화 융합에 관여

α-TTP는 주로 간의 세포질에 존재하며 α-T를 선택적으로 흡수한다.  α-TTPKO의 골조직 형태를 측정한 결과, 야생형 마우스(WT)에 비해 α-TTPKO에서는 단위골량(% BV/TV)이 유의하게(P<0.05) 증가하는 것으로 밝혀졌다.

파골세포 표면(% Oc.S/BS)이 줄어들자 골흡수는 억제되지만 골형성에서는 WT와 유의차는 나타나지 않았다. 또한 높은 α-T식(높은 비타민E 식사)을 α-TTPKO에 추가한 결과, 골량 증가는 억제되는 것으로 나타났다.

이러한 상황을 고려해 후지타 교수는 관련 메커니즘을 검토하기로 했다. α-TTPKO의 혈청을 이용해 α-TTPKO에서 유래하는 파골전구세포를 배양하자 파골세포의 분화에 커다란 장애가 발생했다. 하지만 WT의 혈청을 이용해 α-TTPKO 유래 파골세포 전구세포를 배양해도 분화에는 문제가 없었다.

따라서 파골세포 전구세포 자체에 이상은 없으며, 혈청 α-T의 부족이 골량 증가에 관련한다는게 후지타 교수의 견해다.

또한 파골세포 분화 후기에 α-T를 첨가하면 파골세포의 다핵화가 더욱 촉진돼 거대화되며 골흡수능력이 항진하는 것으로 나타났다. 이는 파골세포의 융합이 촉진되고 있음을 보여주는 것이다.

α-T로 DC-STAMP 발현 항진

후지타 교수는 정량적 PCR 법을 이용해 배양 파골세포의 분화와 기능에 관련하는 유전자의 발현에 미치는 α-T의 효과를 검토했다. 그 결과, α-T를 첨가할 경우 DC-STAMP의 발현이 유의하게(P<0.05) 증가하는 것으로 나타났다. DC-STAMP는 파골세포의 분화, 융합에 따라 특이적으로 발현하는 7회 막관통형 수용체다.

세포 융합에 중요한 다른 분자 Atp6v0d2, CD47, CD44, Meltrin-α는 α-T 첨가와 무관한 것으로 나타났다.

또한 파골세포 분화에 관련된 전사인자 c-fos, NFATc1, PU.1, RANKL의 신호를 세포 안쪽으로 전달하는 TRAF6 및 파골세포 분화 마커인 칼시토닌 수용체와 주석산 저항성 포스파타제(TRAP) 등에도 변화가 나타나지 않았다.

α-T에 의한 파골세포의 융합촉진 작용은 DC-STAMP를 녹아웃시킨 파골세포와 DC-STAMP 녹아웃 마우스에서 유래하는 파골세포에서는 사라진 것으로 확인됐다.

끝으로 WT 마우스에 비타민E 함량이 많은 음식을 먹이자, 골흡수가 항진해 골량이 줄어드는 것으로 나타났다.

후지타 교수는 "α-T는 DC-STAMP 의존적으로 파골세포 융합과 골흡수를 촉진시키기 때문에 비타민E의 과다 섭취는 골다공증을 일으킬 수 있다"고 결론내렸다.

리세드로네이트 알렌트로네이트 뼈리모델링, 골량구조, 재료특성에 미치는 영향 비교 검토: 폐경 후 골다공증 환자 대상 횡단 연구
(Comparison of Risedronate and Alendronate on Bone Remodeling, Architecture and Material Properties; a Cross-sectional Study in Women with Postmenopausal Osteoporosis)

미국 허슨대 약대 로저 핍스(Roger J. Phipps) 교수는 폐경 후 골다공증(PMO) 여성 환자 100명의 장골능생검표본을 분석하여 리세드로네이트(RIS)와 알렌드로네이트(ALN)가 뼈리모델링이나 골량구조, 골기질재료 특성에 미치는 영향을 후향적으로 조사한 결과 이같이 나타났다고 발표했다.

100명 대상 장골능생검표본 샘플 분석

이번 검토는 8개 시설에서 실시된 PMO 환자를 대상으로 실시한 무작위 횡단관찰 연구다.

대상은 폐경 후 최소 5년이 지나고 ALN(N=68, 평균 69.7세) 또는 RIS(N=32, 평균 70.2세) 1일 1회 제형 또는 주 1 회 제형을 3년 이상 투여해 온 100명.

이들로부터 채취한 장골능 생검표본을 이용해 골조직형태 측정, 마이크로CT, 푸리에변환적외선분광영상(FTIRI)은 해면골 및 피질골의 구조, 리모델링, 석회화, 석회결정화 정도와 콜라겐 가교 비율을 평가했다.

2개군 모두 치료시작 전과 생검 당시 BMD 및 요추 T점수, 대퇴골 T-점수 등에서 유의차가 없었다.

골조직 형태를 측정한 결과, 해면골 리모델링(동적골조직형태 측정)에 관한 파라미터는 RIS군이 ALN군보다 높게 나타났다.

이는 RIS가 ALN보다 뼈 리모델링을 억제하지 않는다는 사실, 즉 골대사 회전이 빠르다는 사실을 보여준다. 골구조 파라미터에 대해서는 2개군에서 뚜렷한 차이는 없었지만, 골량폭은 RIS군이 유의하게 컸다.

RIS군은 해면골 구조와 피질골구조, 골기질의 재료 특성을 ALN군과 동일하게 유지

마이크로 CT 분석에서도 해면골 또는 피질골구조에 양쪽 군 사이에 유의차는 없었다. 하지만 골량폭의 경우 골조직형태 측정에서 나타난 만큼의 차이는 보이지 않았다.

해면골과 피질골에서 석회화 영역의 고저(高低) 비율(해면골 표면골 석회화율, 해면골체적 골석회화율, 피질골표면골 석회화율, 피질골체적 골석회화율)은 골대사 회전 속도와 일치했으며 RIS군에서 각각 유의하게 높았다.

FTIRI 검토에서는 골형성면과 골흡수면에서 석회결정화 정도 및 콜라겐 가교 비율은 ALN군과 RIS군에 유의차가 없었다.

콜라겐 가교 비율에 대해서는 양쪽 군 모두 과거에 보고된 위약군 수치보다 낮았으며 골기질 재료특성에 대한 양쪽 군의 효과가 같은 것으로 나타났다. 리세드로네이트에 의한 골기질 재료 특성의 유지와 정상화는 선행연구의 결과와 같았다.

이상의 내용을 근거로 핍스 교수는 "뼈 리모델링과 석회화에 관한 이번 결과는 임상 용량의 ALN와 RIS의 해면골 및 피질 골의 골대사 회전의 억제도 차이를 반영하는 것으로 보인다. RIS 리모델링 억제 작용은 ALN보다 약하지만 해면골과 피질골의 구조와 골기질의 재료 특성을 유지하는 작용은 같았다. 이번 데이터는 골절 위험 감소에는 뼈구조와 골기질 재료 특성 유지가 석회화와 골염량 증가보다 중요하다는 견해를 지지하는 것"이라고 말했다.

트립토판 분해 키누레닌 경로 활성화는 골아세포 생성에 중요
(Activation of the Kynurenine Pathway of Tryptophan Degradation Plays a Role in Osteoblastogenesis)

트립토판 분해의 최종 산물인 장 유래의 세로토닌(Gut-Derived Serotonin; GDS)을 억제하는 약물이 골다공증 환자의 골형성 촉진제가 될 수 있다는 보고가 최근 잇달아 발표되고 있다.

트립토판의 분해는 골세포 분화에 중요한 역할을 할 가능성이 있다.

IFN감마에는 강력한 골량 증가작용과 비면역세포에서의 세로토닌 분비 억제 효과, 면역계와 암세포 트립토판의 분해 및 촉진 효과가 있다고 알려져 있다.

그 결과, IFN감마의 골량증가 작용은 IFN감마의 아주 강력한 인돌아민-2, 3-디옥시게나제 (IDO) 활성 촉진 효과로 부분적으로 설명할 수 있을 뿐만 아니라 키누레닌 경로의 활성 화는 향후 골다공증의 새로운 골형성 치료에 일익을 담당할 수 있는 것으로 보고됐다.

IFN감마 함유 배지에서 MSC 배양

인간 간엽계 줄기세포(MSC)가 골아세포로 분화 유도되데 있어서 키누레닌 경로가 담당하는 역할을 평가하기 위해 두케 교수는 다음과 같은 실험을 실시했다.

우선 MSC를 IFN감마(100nM)가 든 골아세포 유도 배지 (OIM)에서 1주일간 배양하고 vehicle(위약) 배지와 비교했다.

분화가 유도되지 않은 MSC, jurkat cell와 인간 T림프구도 같은 조건으로 배양시켰다.

1주일 후 마이크로어레이 분석을 통해 다양한 유전자 발현의 변화를 평가하고, 유의한 변화에 대해서는 실시간 PCR법과 웨스탄블로트법으로 확인했다.

골아세포의 분화와 기능은 각각 알칼리성 및 알칼리포스파타제 및 알리자린 레드(alizarin red)로 평가했다.

트립토판과 키누레닌은 배양 상청 속의 농도를 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)법으로 측정. 세로토닌 농도는 ELISA 법으로 측정했다.

세로토닌 생산 억제않고 골형성 촉진 가능성

트립토판 하이드록실라제(tryptophan hydroxylase, TPH)라는 효소의 발현량은 OIM+INF감마 배지에서 1주간 배양시켜도 거의 변화하지 않았다.

한편 IDO의 발현량은 OIM+IFN감마 배지에서 뚜렷하게 항진하는 것으로 나타났다.

또한 지난해 발표된 것처럼 OIM에서 배양해 INF감마로 처리한 MSC는 vehicle군에 비해 석회화가 촉진됐다.

이 효과는 IFN감마 첨가군 키누레닌/트립토판비(比)의 뚜렷한 상승, 즉 키누레닌 경로를 통한 트립토판 분해의 항진과 일치했다.

반면 세로토닌 분비량은 INF감마의 첨가로 경미하지만 유의하게 증가했다.

두케 교수는 골아세포 형성에서 트립토판 분해 경로의 새로운 역할을 제안하고 "TPH를 억제시키면 GDS 생산이 억제되기 때문에 간접적으로 골아세포 형성 유리하게 작용한다. 한편 IFN감마가 활성화하는 IDO로 트립토판을 키누레닌 대사 경로를 촉진시키면 세로토닌 분비에 관계없이 직접 요골섬유아세포 형성을 유도할 가능성이 있다"고 밝혔다.

비타민D치 낮으면 노인남성 사망률 증가: MrOS Sweden 연구
(Low Vitamin D is Related to Increased Mortality in Elderly Men: MrOS Sweden)

비타민D가 부족하면 사망 위험도 높아진다고 보고되고 있다.

일반적으로 양쪽의 상관 관계가 나타난 연구에서는 혈청 25수산화 비타민D농도[혈청 25(OH)D 농도]가 낮은 곳에서 높은 곳으로 가면서 사망 위험이 낮아지는 것으로 나타났다.

하지만 혈청 25(OH)D의 고농도와 사망위험 감소 간의 관련성은 약하며 양쪽의 상관 관계가 선형적이지 않았으며 관찰기간이 길어질 수록 상관 관계가 약해지는 것으로 나타났다.

혈청 25(OH)D 농도의 표준편차(SD)1 저하 당 총사망 28% 상승

대상은 웁살라, 예테보리, 말뫼 등 스웨덴의 3개 도시에서 등록된 주민 노인남성 3,014명. 등록 당시 70~81세였으며 추적기간은 최장 6.5년(평균 4.5 년)이었다.

Competitive RIA법으로 혈청 25(OH)D 농도를 측정, BMI와 계절을 이용해 조정하고 z 스코어를 확인했다.

사망위험은 포아종회귀모델로 분석해 단변량분석에서 유의했던 인자(골밀도, 암, 협심증, 당뇨병, 고혈압, 전반적인 건강도)를 보정한 다변량 분석을 통해 혈청 25(OH)D 농도와 사망위험의 상관관계를 검토했다. 아울러 혈청 25(OH)D 농도와 사망위험 간의 비선형 관계에 대해서도 관찰했다.

등록 대상 중 382명이 추적기간에 사망했다. 혈청 25(OH)D 농도가 낮으면 사망위험이 유의하게 높아졌으며, 혈청 25(OH)D 농도의 표준편차(SD)가 1 낮아질 때마다 등록시 총사망 위험비(gradient risk; GR)는 1.28[95% 신뢰구간(CI) : 1.15~1.43, 연령과 추적기간 수정 후]이었다.

또한 인자(골밀도, 암, 협심증, 당뇨병, 혈압, 일반적 건강도)를 추가 보정한 다변량 분석에서 얻은 총사망위험비는 1.20(95% CI : 1.07~1.34)이었다.

관찰 3년간 혈청 25(OH)D 저농도가 사망위험 예측인자

전체 혈청 25(OH)D 농도 범위에서 농도와 사망위험 간에 직선적인 상관관계가 있는지를 검토하는 다변량 분석도 실시했다.

2년간 관찰에서 양자 간에 직선적인 상관 관계는 나타나지 않아, 혈청 25(OH)D의 농도가 높을수록 사망위험 예측인자로서 가치는 떨어졌다. 역치는 약 75nmol/L로 추측됐다.

예컨대 혈청 25(OH)D 농도가 50nmol/L과 75nmol/L인 남성을 비교하면 전자의 사망위험은 42% 높았지만, 75nmol/L, 100nmol/L인 남성을 비교한 경우에는 후자의 사망위험이 6% 낮아지는데 불과했다.

관찰기간 별로 양쪽의 관련성이 어떻게 변화하는지도 검토했다. 이에 따르면 75세 남성을 3년간 관찰한 경우 2년 관찰한 경우와 동일한 상관관계(단 역치는 약 50nmol/L로 이동)가 나타난 반면, 6년간 관찰한 경우 혈청 25 (OH) D 농도의 사망위험 예측인자로서 가치는 거의 없어졌다.

이러한 결과를 근거로 요한슨 교수는 "노인남성에서 혈청 25 (OH)D 농도와 사망 간에 유의한 상관 관계가 나타났다. 이 관계는 선형적이지 않고, 혈청 25(OH)D 농도가 높을수록 사망위험이 낮아지는 현상은 미미했다. 반면에 낮을수록 사망위험은 높아졌다. 이 경우의 역치는 50~75nmol/L인 것으로 나타났다. 또한 이러한 상관 관계는 관찰기간이 길수록 약해져 예측 인자로서 효과는 낮았다"고 결론내렸다.

관절염환자에서 에터나셉트를 이용한 글루코코르티코이드 감량효과와 골무기질 대사에 미치는 영향
(Effect of tapering glucocorticoids for bone and mineral metabolism in patients with rheumatoid arthritis taking etanercept)

조직의 염증을 억제시키는 글루코코르티코이드(GC)가 류마티스관절염(RA)치료에 응용되고 있는 가운데 장기 투여시 스테로이드성 골다공증을 초래해 골절 가능성이 문제로 지적되고 있다.

기다 교수는 RA환자에서 GC에 에너타셉트(ETN)를 병용하면 GC 투여량이 얼마나 줄어드는지를 골칼슘 대사의 변화를 골대사 마커 등으로 측정했다.

그 결과, 글루코코르티코이드 투여량이 줄어들고 이로 인해 뼈가 약화되는 것을 막을 수 있는 것으로 나타났다.

에터나셉트 병용에 의한 글루코코르티코이드 투여량 감소효과와 골형성 및 흡수 마커에 미치는 영향 검토

대상은 비스포스포네이트를 투여받는 RA환자 30명. 이들을 GC 투여군(16명)과 비투여군(14명)으로 나누고 양쪽에 에터나셉트 25mg을 주 2회씩 24주간 투여했다.

투여시작 전과 24주 후에 Disease Activity Score(DAS）28ESR（4) 및 modified Health Assessment Questionnaire(mHAQ)로 질환 활동성 및 QOL을 평가했다.

동시에 골대사마커인 골형 알칼리포스파타제(BAP), 저(低)카르복실화 오스테오칼신(ucOC), 오스테오칼신(OC), 요중 1형 콜라겐 가교 N-텔로펩타이드(NTx), 혈청중 골형주석산 저항성 포스파타제(TRAP-5b), 혈청 보정 총칼슘(Ca) 및 인(P)을 측정했다.

GC투여군과 비투여군은 나이(각각 57.5±4.7세, 52.4±10.8세), 이병기간, 병기 등의 환자 배경이 같았다.

또 투여시작 당시 ucOC(GC투여군 2.7±1.5ng/mL，비투여군 6.1±3.2ng/mL，P＜0.01），OC（GC투여군3.6±1.9ng/mL，비투여군 6.6±1.3ng/mL，P＜0.001），Ca（GC투여군 9.7±0.3mg/dL，비투여군 9.2±0.2mg/dL，P＜0.001)에 대해서는 양쪽군 사이에 유의차가 나타났다.

또 BAP는 GC투여군 24.3±9.2U/L，비투여군 27.7±10.2U/L으로 나타나 GC투여군에서 낮아지는 경향을 보였다.

에터나셉트는 골형성마커 증가:GC는 골위약화 억제

글루코코르티코이드 투여량은 시험시작 당시는 1일 5.0±3.3mg이었지만 24주 후에는 2.6±1.4mg로 절반가량 줄었다.

투여전 DAS28ESR(4) 점수는 GC투여군 6.5±1.2，비투여군 5.6±1.5이었고 투여 후에는 각각 4.0±1.3，3.6±1.0으로 나타나 2개군 모두 유의차가 없이 에터나셉터 투여 후에는 개선된 것으로 나타났다.

mHAQ 역시 투여 전과 후에 2개군간 유의차는 없어 모두 에터나셉트 투여 후에 개선됐다.

골형성마커인 BAP，OC 및 ucOC농도는 GC투여군에서 투여 전 보다 투여 후에 유의하게 증가했다. 비투여군에서도 모두 증가 경향을 보였다.

골흡수마커의 경우 요중 NTx에 대해서는 GC투여군, 비투여군 모두 에터나셉트 투여 후 큰 변화는 없었지만 TRAP-5b는 GC투여군에서 유의하게 높아졌다.

혈청 Ca는 GC투여군에서는 에터나셉트 투여 전 9.7±0.3mg/dL에서 투여 후 9.3±0.3mg/dL, 비투여군에서는 9.2±0.2mg/dL에서9.1±0.1mg/dL로 나타나 모든 군에서 유의하게 감소했다.

이상의 결과에서 에터나셉트는 단독투여 및 GC와 병용시 RA의 염증을 억제하고 임상증상 및 신체활동성 장애를 유의하게 개선시키는 것으로 나타났다.

또 글루코코르티코이드 투여례에서는 에터나셉트를 병용함으로써 임상효과를 유지하면서 글루코코르티코이드를 줄일 수 있는 것으로 나타났다.

기다 교수는 "에터나셉트는 골형성을 촉진시키고 글루코코르티코이드 투여로 뼈가 약해지는 것을 억제할 가능성이 있다"고 결론내렸다.

페경 2형 당뇨여성, PTH 분비 저하가 골형성저하·척추골절 위험 유발
(Decreased PTH Secretion is Associated with Low Bone Formation and Vertebral Fracture Risk in Postmenopausal Women with Type 2 Diabetes)

2형 당뇨병 환자는 비당뇨병환자에 비해 골밀도(BMD)가 높아도 대퇴골 근위부 골절과 척추골절 위험이 높아 BMD에 반영되지 않은 골질 저하가 있다고 알려져 있다.

그 원인에는 2형 당뇨병환자에서는 부갑상선호르몬(PTH)과 골대사마커인 오스테오칼신(OC)의 혈중농도가 낮고, 골질의 주요 구성인자의 하나인 골대사회전이 억제됐을 가능성이 제시되고 있다.

그러나 투석을 받지 않은 2형 당뇨병환자의 척추골절 위험에도 PTH와 OC의 저하가 관련하는지는 확실하지 않다.

일본시마네의대 야마모토 마사히로 교수는 이러한 환자군에서도 PTH의 저하와 골대사회전의 억제가 BMD와는 독립적으로 척추골절 위험을 일으킨다는 사실을 밝혀냈다.

2형 당뇨병환자에서는 남녀 모두 PTH와 OC가 크게 줄어

이번 시험의 대상은 시마네대학 부속병원 외래 당뇨병환자 255명. 여성은 123명이고 모두 폐경여성(64.3±8.7세) 이고 남성은 132명(65.1±8.4)이었다. 대조군은 2형 당뇨병에 걸리지 않은 여성 189명(63.1±7.5세), 남성 51명(71.2±7.0세)이었다.

평가항목으로는 요추, 대퇴골경부 및 요골원위단 1/3의 BMD측정, 전기화학발광면역측정법(ECLIA)을 이용한 혈중 intact PTH（PTH), N-mid OC(OC), I형 프로콜라겐 가교 N-프로펩타이드(P1NP), I형 콜라겐의 C말단 프로펩타이드 분해산물인 베타 크로스랩스(β-CTX)를 측정했다.

척추골절은 흉골추의 측면 X선 사진을 반정량적으로 평가했다. 신기능에 이상이 있는 경우는 제외시켰다.

그 결과, 2형 당뇨병환자에서는 남녀 모두 대조군에 비해 혈중 칼슘(Ca)와 인(P) 농도가 유의하게 높았지만(여성: P＜0.001, 남성:P＝0.002), PTH와 N-mid OC，P1NP，β-CTX는 유의하게 낮았다.

이어 2형 당뇨병 환자에서 PTH，HbA1c，OC에 대한 상관관계를 검토했다. PTH를 독립 변수로 하여 단회분석한 결과, 당뇨병환자에서 남녀 모두 상관성이 나타난 것은 OC 뿐이었으며, HbA1C와의 상관관계는 나타나지 않았다.

PTH를 독립변수로 하여 나이, 비만지수(BMI), 혈청크레아티닌(Cr), Ca, P로 보정한 다변량분석 결과에서도 PTH와 OC 간에 밀접한 상관관계는 유지됐다(여성:r＝0.334，P＜0.001。남성:r＝0.346，P＜0.001).

PTH저치와 OC저치의 합병으로 폐경여성의 척추골절 위험은 유의하게 증가

또 2형 당뇨병환자를 PTH와 OC의 수치에 기초해 4개군으로 분류하고 나이, BMI, Cr, 요추BMD로 보정한 로지스틱회귀분석으로 척추골절 위험과의 상관관계를 검토했다.

그 결과, 2형 당뇨병여성환자만 PTH와 OC 수치가 모두 낮은 군에서 모두 높은 군에 비해 척추골절위험이 유의하게 높아졌다[오즈비 （OR):4.27，95％(CI）：1.13~16.06，P＝0.032].

또 HbA1C, 당뇨병이병기간, Ca, P, 피오글리타존복용, 당뇨병 합병증을 보정인자로 추가한 분석에서도 이러한 경향은 계속 나타났다(OR：7.02，95％CI：1.34~36.75，P＝0.021).

야먀모토 교수는 "이번 성적에서 2형 당뇨병환자에서 PTH의 저하는 골대사회전의 저하와 관련하며 2형 당뇨병 폐경여성 환자에서는  PTH와 OC치가 낮으면 BMD와 독립적으로 척추골절 위험이 높아지는 것으로 나타났다. 따라서 2형 당뇨병환자에서는 BMD가 낮아지지 않아도 PTH분비의 저하 등에 의한 골대사회전의 저하가 골질의 열화를 일으키고 골절 위험을 증가시킬 가능성이 있다"고 결론내렸다.

옥시토신, 에스트로겐 골량증가 작용에 관여
(Oxytocin Mediates the Anabolic Action of Estrogen on the Skeleton)

교수는 OT가 골아세포에 의해 생산되어 에스트로겐의 골량 증가 작용에 필수 인자라고 보고했다.

에스트로겐에 의한 골형성 촉진에 OTR 필수적

2개월령된 OTR녹아웃(OTR-/-) 마우스와 어미가 동일한 야생형(WT) 마우스에 17β-에스트라디올(17βE2) 또는 위약을 30일간 투여했다.

그 결과, WT 마우스는 예상대로 해면골량과 외피골량이 증가했다. 그리고 동적(動的) 골조직 형태를 측정해도 석회화 속도(MAR)가 증가한 것으로 나타났다. 골외막 골아세포 수도 증가했지만 OTR -/- 마우스에서는 이러한 변화가 나타나지 않았다.

또한 17βE2 투여로 WT 마우스 골형성 마커인 오스테오칼신(OC)이 크게 증가했지만, OTR -/- 마우스에서는 약간 증가하는데 그쳤다.

17βE2는 WT 마우스 배양 골수간질세포에 의한 석회화 골아세포 콜로니(CFU-Ob)를 유의하게 더 많이 형성시켰으나 OTR -/-에서는 이런 효과는 나타나지 않았다.

이상의 결과에서 17βE2에 의한 골형성 촉진에는 정상 OTR의 발현이 필요한 것으로 나타났다.

골아세포 전사인자와 오스테오칼신은 OTR 통해 발현 증가

자이디 교수는 OTR이 에스트로겐의 조골세포 형성에 관여하는 메커니즘을 밝혀내기 위해 골아세포 전사인자의 변화를 두개관 골아세포로 검토했다.

골아세포 분화에 필수적인 전사인자 Runx2, Osterix, ATF4의 발현은 17βE2에 의해 WT 마우스에서 크게 증가했지만 OTR -/- 마우스에서는 나타나지 않는다는 사실이 웨스턴블로트법 및 정량적 PCR을 통해 확인했다.

에스트로겐의 골형성 촉진작용이 골아세포를 통해서만 가능한지 여부를 해명하기 위해 RNA interference(siRNA)로 마우스 전골아세포인 MC3T3-E1 세포의 OTR 발현을 녹다운시켰다.

그 결과, OTR를 녹다운시키면 대조군에 비해 Runx2, Osterix, ATF4와 OC의 mRNA 발현량이 크게 줄어드는 것으로 나타났다.

뼈는 "호르몬 분비 기관"

자이디 교수는 OT의 말초 어디에 공급원이 있는지를 밝혀내기 위해 정량적 PCR 및 웨스턴블로트법을 시행했다.

그 결과, OTR과 OT가 모두 골아세포에 발현하고 17βE2는  이들 발현을 시간 의존적으로 증가시킨다는 사실이 확인됐다.

이는 골아세포에 작용하는 에스트로겐이 조골세포 자체가 국소에서 생산하는 옥시토신의 오토크린(autocrine)적 작용을 통해 나타난다는 사실을 보여준다.

또 교수는 OT 및 OTR의 mRNA 발현, 세포 비투과성의 소 혈청알부민(BSA) 결합 17βE2로도 유리 17βE2의 경우와 마찬가지로 강력하게 유도된다는 점에서 17βE2의 이러한 작용은 세포막 수용체를 통한 non-genomic적인 기전에 의한 것이며, 그리고 이러한 작용은 분열 촉진인자 활성화 단백질(MAP) 키나제의 세포외 시그널조절키나제(Erk) 활성화를 통해 나타난다고 밝혔다.

그러나 Erk 인산화 억제제인 PD98059에서 억제되는 것은 OT의 mRNA 발현 뿐이며 OTR의 mRNA 발현은 억제되지 않았다.

자이디 교수는 "이번 성적은 뇌하수체-골축(pituitary bone axis)라는 새로운 개념에 대한 우리의 기초 지식을 더욱 확실하게 해 줄 뿐만 아니라, 골수가 새로운 OT 생산원이라는 사실을 보여준 것으로 "호르몬 생산 내분비기관으로서의 뼈"라는 개념을 강화하는 것"이라고 말했다.

리세드로네트, in vitro에서 조골세포 분화 촉진 코넥신43(Cx43) 프로모터 활성
(Risedronate Increases Osteoblastic Differentiation and Up-regulates Connexin43 Promoter Activity In Vitro)

이는 뼈와 결합하는 친화력과 파골세포의 farnesyl diphosphate (FPP) syntahses에 대한 억제 활성 차이 때문이라고 한다.

한편 비스포스포네이트가 골세포와 골아세포에 영향을 주는 것으로 나타나 비스포스포네이트는 코넥신43(Cx43) 헤미채널(hemichannel)을 개방시켜 골세포 사멸을 억제시킨다고 보고되고 있다.

정 교수는 리세트로네이트가 골아세포의 분화와 Cx43 발현에 미치는 영향을 배양 마우스근아세포주인 C2C12세포주를 이용해 검토한 결과, 리세트로네이트가 골형성 단백질(BMP_2와 상호 상승작용을 통해 골아세포 분화를 촉진시키고 Cx43 발현을 촉진시킨다고 보고했다.

리세드로네이트는 BMP-2와 상승작용 통해 골아세포 분화 촉진

다양한 용량의 리세드로네이트를 C2C12세포에 첨가하여 Runx2의 응답배열인 osteoblast specific element(OSE), 오스테오칼신, 본시알로프로틴(BSP), Cx43의 프로모터 활성에 미치는 영향을 루시퍼레이스에 의해 알칼리포스파타제(ALP) 활성에 미치는 효과를 ALP염색으로 검토했다.

또 골아세포의 분화에 필요한 전사인자인 Runx2, Dlx5，Osterix를 C2C12 세포에 도입하고 Cx43 프로모터 활성에 미치는 영향을 루시퍼레이스로 평가했다.

또 리세드로네이트 첨가와 Runx2 또는 Dlx5 도입의 병용의 효과도 마찬가지로 평가했다.

OSE의 프로모터 활성은 리세드로네이트의 용량의존성으로 증가하고 50μM 첨가로 최대 활성에 도달했다. 오스테로칼신과 BSP의 프로모터 활성은 리세드로네이트 25μM 첨가시 증가했으며 50μM 첨가시 최대에 도달했다.

마찬가지로 ALP활성은 리세드로네이트의 용량의존성으로 증가하고 BMP-2（5ng/mL)아 리세드로네이트를 동시 첨가하면 BMP-2 단독 첨가에 비해 ALP활성 항진은 증가됐다.

정 교수는 "이들 결과는 리세드로네이트가 BMP-2와의 상승작용으로 골아세포의 분화를 촉진시킨다는 사실을 보여준다"고 말했다.

리세드로네이트는 골아세포 분화를 촉진하고 Cx43 발현 조절

이어 발현 패턴을 이용해 루시퍼레이스 유전자와 각종 전사인자를 동시에 도입한 결과, Runx2와 Dlx5는 거의 마찬가지로 농도의존성으로 Cx43 프로모터의 활성을 촉진시켰다. Osterix도 Cx43 프로모터활성을 촉진시켰지만 반응은 Runx2 보다 약했다. 리세드로네이트 첨가로 Cx43 프로모터 활성은 항진하고 대조군에 비해 최대 2.5배에 도달했다.

정 교수는 "Runx2(0.5μg)와 리세드로네이트 동시 투여시 단독 투여 때보다 Cx43 프로모터가 더 뚜렷하게 활성됐다다"고 말하고 "이것은 Cx43 프로모터 활성화가 비스포스포네이트와 Runx2의 상호 작용이 관계한다는 사실을 나보여주는 것"이라고 지적했다.

비슷한 증강작용은 Dlx5(0.5μg)와 리세드로네이트(10μM) 병용시 나타났다. 또한 실시간 PCR은 리세드로네이트가 Cx43, Runx2, Osterix, Dlx5의 발현을 촉진시키는 것으로 확인됐다.

이상의 결과에 따라 정 교수는"C2C12 세포를 이용한 이번 in vitro 검토는 리세드로네이트가 BMP-2와 BMP-2에 관련한 전사인자의 상승 작용을 통해 조골세포의 분화와 Cx43 발현을 촉진하는 것으로 나타났다"고 결론내렸다.