최근 심이식 후의 생착률은 상당히 향상돼 구미에서는 5년 생존율이 약 70%로 보고되고 있다. 그러나 이식 후 2년이 지나면서 생존율은 거의 직선적으로 낮아진다. 그 최대의 원인은 만성거부라 불리는 관동맥경화증의 합병이며, 이식 후 수개월부터 수년내 관동맥협착이 진전한다.
만성거부의 병태는 죽상동맥경화증과는 달리 중소동맥을 중심으로 하는 말초성 미만성 병변으로 평활근의 증식과 세포외 매트릭스의 증생(增生)에 의해 혈관내막이 비후하고 만성적인 허혈을 초래한다.
이러한 병태는 정도에 차이는 있어도 대부분의 이식심장에서 나타난다. 또 수혜자의 연령에 상관없이 이식 후 5년째에는 약 절반에서 발생한다고 보고되고 있다. 그러나 어째서 이러한 병태가 발생하는지 그 원인은 밝혀지지 않고 있다. 현재로서는 재이식외에는 효과적인 치료법은 없다고 한다.
이식환자의 장기예후를 좌우하는 이 만성거부의 발생기전에 대해 이소베교수는 다음과 같은 가설을 주장하고 있다.
이식심장은 수술 전후에 여러 자극에 노출된다. 하나는 심적출에서 이식할때까지 발생하는 절대적 허혈에 기인하는 허혈재관류장애. 하나는 장기 운반에 동반되는 물리적, 기계적 자극. 그리고 급성거부반응. 이들 자극은 모두 관동맥이 강한 염증반응을 야기하며 그 수복기전으로서 혈관평활근의 증식이 발생한다. 이것이 만성거부의 유인(誘因)이 된다고 생각된다.
마우스 이식심장에 NFkB의 디코이(미끼형핵산화합물)을 투여하는 이번 조교수팀의 시도는 혈관의 염증을 억제함으로써 이식후 관동맥경화를 개선시킬 수 있을지 검토를 통해 만성거부의 기전해명과 치료전략을 탐색할 목적으로 실시된 것이다.

염증의 Key molecule ‘NFkB''''

NFkB는 혈관의 장애에 동반해 생산되는 사이토카인 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 또는 ICAM-1, VCAM-1에 대표되는 접착분자 등 염증반응에 관여하는 많은 인자의 유전자발현을 조절하는 다기능의 전사(轉寫)인자로 알려져 있다.
p50서브유니트와 p65서브유니트의 헤테로다이머로 구성되며, 통상은 억제성단백질의 IkB와 결합하여 세포질안에서 불활성형으로 존재한다. 외래에서 자극을 추가할 수 있다면 IkB로부터 해리(解離)하여 핵내부로 이행하여 사이토카인이나 접착분자를 코드하는 표적유전자의 프로모터 또는 인핸서(enhancer) 영역과 결합하여 전사를 촉진시킨다.
이 전사를 저해하는 기능을 가진 것이 디코이다. 디코이는 상기한 인핸서영역의 NFkB 결합부위와 동일한 배열을 갖도록 합성시킨 2중쇄(鎖) 올리고누클레오티드(oligonucleotide)이며 NFkB를 이른바 ‘미끼’로 덫을 놓아 표적유전자의 발현을 억제한다(그림1).


그림1. NFkB 활성화와 이코이투여에 의한 활성화 저해


세포내로 디코이를 투여하는데는 HVJ(hemagglutinatig virus of Japan;센다이바이러스)-리포솜법으로 실시한다.
HVJ-리포솜법은 불활성한 HVJ를 지질 2중막의 소포인 리포솜과 융합시킨 복합체에 디코이를 봉입하여 세포 또는 세포내 도입한다(그림2). HVJ는 우수한 세포융합능을 가지고 있어 매우 높은 유전자도입 효율을 얻을 수 있다. 원숭이 이식심장을 이용한 실험에서는 약 10분만에 외래유전자를 도입할 수 있고, 정주의 대량투여에서도 거의 부작용을 보이지 않는 것으로 확인됐다.
마우스에서 적출한 심장에 HVJ-리포솜법을 이용해 ex vivo에서 NFkB디코이를 투여한 후 이식을 실시하고 28일 후에 관동맥을 병리조직학적으로 검토했다. 이때 무처치군 외에 E2F디코이투여군과 cdk2키나제 mRNA의 안티센스투여군을 컨트롤하여 NFkB디코이의 효과를 검토했다.


그림2. HVJ-리포솜법에 의한 이식심장으로의 외래 유전자 도입




NFkB디코이 투여로 마우스 이식심장의 관동맥내막 비후 억제

E2F와 cdk2키나제는 모두 세포주기의 진전에 관련된 인자로서, 전자는 세포주기를 G1기(期)에서 S기로 진행시키는데 필요한 유전자군의 발현을 촉진시키는 전사인자, 후자는 G1사이클린이라 불리는 일군(一群)의 효소 중 하나다.
이소베 교수팀은 이전부터 오사카대학 연구팀과 공동으로 심이식모델에 대한 E2F디코이의 투여, cdk2키나제 mRNA에 대한 안티센스올리고(cdk2키나제mRNA와 상보적 배열을 가진 짧은 합성핵산.
센스쇄(鎖)와 결합하여 발현을 막는다)를 투여해 혈관평활근의 증식억제에 양호한 성적을 얻었다. 이번 실험결과의 비교에 상기의 연구성과를 인용했다.
건강한 혈관단면 현미경상에서는 내막 탄성판 안쪽에는 얇은 내피가 나타날뿐이다. 그러나 이식 후 무처치군에서는 신생내막의 발현이 뚜렷하게 나타난다. NFkB디코이, E2F디코이, cdk2키나제mRNA 안티센스의 각 투여군에서는, cdk2키나제mRNA안티센스 투여군에서 약간 신생내막의 발현이 많았다(그림3a, 앞 페이지). 또 내막탄성판의 내측 신생내막 점유율을 정량적으로 검토한 성적에서는 NFkB디코이투여군은 E2F디코이투여군보다 약간 증식률이 높았지만, 내막비후가 상당히 잘 억제됐다(그림3b, 앞 페이지).


그림3. 마우스이식심에 대한 NFkB디코이의 투여효과(이식후 28일째)




NFkB디코이투여군에서 ICAM-1, VCAM-1의 발현도 억제됐으며 특히 VCAM-1의 발현억제효과는 다른 핵산 투여군보다 훨씬 우수했다. 주요 조직적합항원의 형태가 다른 마우스이식심은 무치료에서는 10일밖에 갖지 못하지만 NFkB디코이 투여에 의해 생착기간을 20일 이상 연장시킬 수 있었다.

유전자치료 이용한 이식심 개변이 목표

이소베 교수는 이번 결과에 관해 『동물모델에서는 NFkB디코이나 E2F디코이 모두 만성거부를 매우 잘 억제시키는 것으로 밝혀졌다. 다만 양쪽의 활성화에는 시간상 지연이 발생하므로 NFkB는 이식수술의 당일부터 신속하게 활성화돼 염증반응을 유도한다고 생각되는데 반해 E2F의 활성화에 의한 평활근의 분열은 좀더 늦은 시기에 일어나는 것으로 보인다. 따라서 장래적으로는 양쪽의 사용구분 또는 콤비네이션 치료도 생각할 수 있다』고 말한다.
NFkB디코이는 1회 투여로 어느정도의 유효성이 지속하는지, 반복 투여가 필요한 경우 얼마만큼을 몇회 투여하면 좋은지 등의 문제는 앞으로도 검토과제라고 한다. 또 투여조건도 초회를 제외하고는 in vivo투여가 된다. NFkB디코이의 in vivo투여는 심근경색의 동물모델에서 유효성을 밝혀졌으며 이소베 교수팀도 최근 심근염인 동물모델에 대한 투여에서 양호한 결과를 얻었다.
일본 후생성은 밀레니엄 프로젝트의 일환으로 재생의료(再生醫療)를 내세우고 있다. 최근 그 하나의 섹션으로 이소베 교수를 반장으로 한 장기이식관련 연구반이 출범했다.
동교수는 『우리가 시도하는 이식심장에 대한 유전자치료는 이른바 이식장기를 보다 좋은 상태로 바꾸려는 시도이다. 이식은 적출장기에 개변을 가해도 수혜자에게는 부담을 주지 않는다는 점에서 유전자치료에 매우 적합한 분야다. 장기이식은 장래적으로는 세포이식을 중심으로 하는 재생의료로 옮겨갈 것으로 생각되는데 유전자도입에 의한 이식장기의 개변은 양쪽을 중개하는 어프로치로서 위치시킬 수 있다고 생각된다』고 말한다. 현재 염증반응의 억제나 세포주기의 억제에 의한 만성거부개선의 시도와 함께 이식심장에 면역관용을 유도하는 시도도 실시될 예정이며 올해 중점화된 동경의과치과대학 대학원에서의 주요 연구프로젝트의 하나라고 한다.