세리바스타틴은 내피에서 NO합성효소를 증강시킨다
취리히대학병원 Zhihong Yang氏
Yang씨 등 4명의 연구팀은 트롬빈유발 내피기능부전에 대한 세리바스타틴(Lipobay￡)의 예방적역할이 관상동맥질환환자에서 HMG-CoA환원효소저해제의 새로운 기전이 될 수 있다며 다음과 같이 발표했다.
연구팀은 Thomas Luscher씨를 중심으로 세리바스타틴이 내피기능에 미치는 영향을 검토하는 대규모시험 “ENCORE (Evaluation of Nifedipine and Cerivastatin On Recovery of Endothelial Function) study”를 실시했다.
eNOS유전자발현에 대한 트롬빈의 영향
프로테아제인 트롬빈은 응고 및 혈전형성에 중요한 역할을 담당하며 2개의 트롬빈수용체(PAR1 및 PAR3)가 클로닝된 이후 내피세포 등 다른 계(系)나 세포에 대한 이 효소의 다양한 기능이 연구돼 왔다. 본 시험에서는 배양한 사람제대정맥 내피세포에서의 eNOS유전자발현에 미치는 트롬빈의 영향을 검토하고 세포내 시그널메커니즘에 대해서도 분석했다.
제대정맥에서 사람 내피세포를 단리하고 0.5%FCS에서 24시간 배양시킨 후 아고니스트로 자극했다. 면역블로트법으로 eNOS단백발현을 분석한 결과, 트롬빈(4U/ml)을 이용한 내피세포에 대한 24시간 자극으로 eNOS단백레벨이 현저하게(58% 감소) 감소했지만, 고농도(10μM, 24시간)인 플로트타입 트롬빈수용체(PAR1) 아고니스트 펩타이드(SFLLRN)에는 영향을 미치지 않았다.
트롬빈에 의한 eNOS단백의 감소는 저분자GTP결합단백 Rho저해제인 C3균체외효소(10㎍/㎖)에 의해 완전히 억제되는데 마이토젠활성화 프로틴키나제(MEK)저해제인 PD98059(50μM)나 p70S6K저해제인 라파마이신(10μM)으로는 억제되지 않았다. 여기에 대응해 내피세포내에서 트롬빈에 의한 MAPK 또는 p70S6K의 자극은 나타나지 않았다. HMG-CoA환원효소저해제인 세리바스타틴(1μM)은 Rho저해작용을 보이고 트롬빈에 의한 eNOS의 감소를 완전히 억제했다. 이렇게 사람 내피세포를 트롬빈에 만성노출시키면 적어도 2개이상의 트롬빈수용체를 매개하는 Rho의 활성화를 통해 eNOS발현이 억제된다.
eNOS발현에 대한 트롬빈의 영향은 동맥경화에서의 내피기능부전을 유발하고 트롬빈유발 내피기능부전에 대한 세리바스타틴의 작용은 관동맥질환자에서의 HMG-CoA환원효소저해제의 효과의 새롭게 제시된 기전이라고 생각된다.
세리바스타틴은 내피에 대한 백혈구접착을 억제한다
동경의치과대학 난치병연구소 Masayuki Yosida氏
Yosida등 6명의 연구팀은 세리바스타틴이 혈관내피의 단구접착을 감소시키는 효과에 대해 다음과 같이 보고했다.
HMG-CoA환원효소저해제(스타틴)이 내피기능을 개선시킨다는 사실은 보고됐지만, 고콜레스테롤혈증 동물모델을 이용한 몇몇 실험 결과, 스타틴투여에 의해 혈관벽에 대한 호중구의 접착률을 유의하게 감소시킨다는 사실이 밝혀져, 스타틴의 콜레스테롤저하에 의존하지 않는 작용이 나타났다. Yosida등의 시험에서는 이 스타틴의 콜레스테롤저하에 의존하지 않는 작용의 기전을 해명하기위해 생리적 조건하에서 스타틴이 활성화 또는 아데노바이러스 수식혈관내피에 미치는 단구접착에 미치는 영향을 관찰했다.
우선 단구-내피상호작용에 대한 HMG-CoA환원효소저해제의 직접적인 영향을 평가하기위해 세리바스타틴존재하에서 단구세포주 U937을 48시간 배양하고 사람제대정맥내피세포(HUVEC), 활성화(IL-1-β 10IU/ml, 4시간) 또는 사람E-세크레틴 cDNA편입 아데노바이러스를 도입한 상태의 것을 이용하여 정적(靜的)접착 어세이를 실시했다.
U937에 대한 세리바스타틴의 작용에 Rho의존경로저해가 관여
U937을 세리바스타틴으로 전처리한 결과, 미자극HUVEC(무처리 U937접착 4.5%, 세리바스타틴처리 U937접착 1.78%), 활성화상태(11.73%, 2.3%) 또는 E-세크레틴도입(9.94%, 1.99%)에서의 U937접착이 농도의존적으로 유의하게 감소했다.
세리바스타틴 처리후의 U937의 FACS분석 결과, CD11a, CD18 및 VLA4의 감소가 나타났다. 세리바스타틴에 의한 U937접착의 변화는 콜레스테롤생합성경로의 중간생성물인 10μM L-메바론 산 처리로 회복했다.
세포골격 및 세포운동성의 제어에 중요한 역할을 담당하는 저분자GTP결합단백Rho의존경로가 세리바스타틴에 의한 단구접착저감에 관여하고 있는지 여부를 조사하기위해 U937을 강력한 Rho활성화저해제인 C3독소존재하에서 배양시켰다. 그 결과, C3독소도 활성화HUVEC에 대한 U937접착을 감소시켰다(대조U937접착의 63.7%). 이상에서 세리바스타틴은 인테그린계 접착분자인 CD11a, CD18 및 VLA4의 하방조절을 통해 혈관내피에 대한 단구접착을 감소시킨다고 결론내렸다. 또 U937에 대한 세리바스타틴의 작용에는 Rho의존경로의 저해가 관여하고 있다고 생각된다. 이 지견은 동맥경화증환자에서의 HMG-CoA환원효소저해제의 콜레스테롤저하에 의존하지 않는 작용을 보이고 동맥경화의 초기병변의 형성에 중요한 단구의 혈관침입을 세리바스타틴이 제어할 수 있음을 생각할 수 있다고 요시다씨는 지적했다.
세리바스타틴은 관동맥의 염증성·증식성 변화를 억제한다
큐슈대학 대학원 순환기내과학 Weihua Ni氏
Ni씨, 에가시라씨등 5명의 그룹은 3-하이드록시-3-메틸글루타릴에톤자임A(HMG-CoA)환원효소저해제가 래트NO합성만성저해 모델에서의 관혈관염증성 변화 및 증식성 변화를 감약한다고 다음과 같이 발표했다.
최근 HMG-CoA환원효소저해제(스타틴)이 심근경색 및 허혈발작의 발현율을 감소시킨다는 사실이 밝혀졌다. 스타틴의 효과는 주로 그 지질저하작용에 의한 것이지만, 임상시험 데이터분석에 의해 콜레스테롤저하 비의존작용이 있음이 제시됐다. 내피유래일산화질소(NO)의존성 혈관반응성의 회복은 스타틴치료의 초기효과의 하나이며 또 동물에서의 Nω-니트로-L-알기닌메틸에스텔(L-NAME)에 의한 NO합성의 만성저해가 심혈관염증성 및 증식성변화를 유발한다는 사실도 밝혀졌다. 여기서 Ni씨등은 스타틴투여가 콜레스테롤저하에 의존하지 않고 이런 동맥경화 전변화를 감약하는지 여부를 검토했다.
스타틴이 심혈관 리모델링을 감약(래트)
래트를 대조군, L-NAME투여군(L군, 100mg/kg/일), L-NAME+세리바스타틴투여군(L+c군, 1, 2, 10mg/kg/일)로 나누고 투여 3일째에 심장 및 대동맥을 절제, 분석한 결과, L군의 심장에 관혈관에 대한 단구 침윤, 증식성 세포핵항원양성세포 및 MCP-1유전자발현의 현저한 증가가 나타났다. 스타틴투여에 의해 혈청 콜레스테롤치나 L-NAME에 의한 수축기혈압상승에는 변화는 없었지만, L-NAME이 유발한 염증성변화 및 증식성 변화는 용량의존적으로 감소했다. 스타틴은 또 L-NAME이 유발한 칼슘이오노포아+L-알기닌 및 Ca2+의존성 NO합성활성에 동반하는 대동맥NO생산능력장애를 회복시켰다.
대동맥내피 NO합성효소단백레벨은 대조군 및 L군에 비해 L+C군쪽이 높았다(그림3). 이들 지견에서 래트NO합성만성저해모델에서 스타틴은 심장의 염증성변화 (단구침윤), 증식성변화(PCNA양성세포) 및 MCP-1발현을 감소시켜 심혈관리모델링을 감약시킨다(그림4). 결국 스타틴이 내피NO합성효소활성에 대한 콜레스테롤저하비의존작용을 통해 관혈관의 염증성 변화 및 증식성변화를 저해한다고 생각된다고 Ni씨는 지적했다.
변종유전자의 근육내주입에 의한 유전자요법의 가능성
큐슈대학 대학원 순환기내과학 Weihua Ni氏
Ni씨, 에가시라씨 등 5명의 연구팀은 변종유전자를 근육내로 이입함으로써 사람에서의 동맥경화에 유용한 유전자요법의 가능성을 다음과 같이 밝혔다.
동맥벽에 대한 단구동원 및 그 활성화는 아테롬형성에서의 중심적과정이다. 단구주화단백(MCP-1)은 중요한 단구주화인자로, 아테롬형성에서의 그 역할이 밝혀졌다. 이런 연구는 항MCP-1요법이 동맥경화증에 대한 실제적인 유전자요법이 될 수 있다는 사실을 시사했다.
MCP-1/CCR-2시그널경로의 중요성은 CCR2결손마우스와 아포리포단백(apo)E결손 마우스를 교배시킨 모델에서 나타났지만 MCP-1시그널의 생후차단이 유일한 부위 특이적유전자요법인지 여부에 대해서는 아직 해명되지 않고 있다. Ni씨가 선택한 것은 in vitro에서 MCP-1시그널의 도미넌트 네거티브인히비터로서 작용한다는 사실이 알려진 사람MCP-1의 N말단 결손변종(아미노산 2~8이 결손)(7ND)이었다. 그들은 7ND감염세포가 순환혈류중에 7ND단백을 분비하고 원격기관중의 표적세포의 MCP-1의 시그널을 차단할 필요가 있다고 가정. 이런 MCP-1활성차단은 염증을 억제하고 표적기관의 기능부전이 개선된다고 생각했다(그림5). 유전자요법의 신전략으로 이 수법이 주효하면 표적기관에 대한 직접적인 유전자도입은 불필요해질 것이다. 그래서 in vivo에서의 골격근에 대한 7ND유전자이입에 의해 MCP-1시그널이 효과적으로 억제돼 apoE결손마우스에서 원격기관(대동맥)의 동맥경화가 예방할 수 있을지를 검토했다.
동맥경화의 발현에는 MCP-1시그널경로가 필수
야생형마우스의 대퇴근에 7ND 유전자를 포함하는 HVJ리포솜을 주사한 후 적어도 3주간은 주사부위의 근육조직에 도입유전자가 검출됐다. 7ND도입에 의해 변환사람MCP-1피내주사에 의해 유도되는 진피로의 단구동원의 유발이 차단됐다. 8주령의 apoE결손마우스에 고지방식을 6주간 투여한 후 0 및 3주째에 7ND발현벡터(5㎍)를 포함하는 HVJ리포솜 옹액을 대퇴근에 주사한 결과, 대동맥벽으로의 단구/마크로파지의 동원 및 동맥경화병변의 발현이 현저하게 억제됐다고 한다. 이들 효과는 국소, 전신 모두 부작용은 나타나지 않았다.
이들 결과는 동맥경화의 발현에는 MCP-1시그널경로가 필수이며 이 새로운 치료전략에 의해 MCP-1의 역할이 해명됐다는 사실을 시사했다. 『7ND를 이용한 항MCP-1유전자요법은 사람에서의 동맥경화에 대한 유용하고도 실현가능한 유전자요법이 될 것』이라고 Ni씨는 발표를 마쳤다.